摘要

早期诊断和个体化精准治疗是提高肿瘤患者生存率、改善生活质量和延长生存期的关键。近年来，随着液体活检技术的发展，越来越多的新型肿瘤标志物被发现，在肿瘤诊断、预后判断和治疗监测等方面表现出较大的潜力，并且部分指标已应用于临床实践。未来研究应重点解决阻碍新型肿瘤标志物实现临床转化的难题，促使更多具有临床应用前景的液体活检指标能够优化肿瘤患者的诊疗过程，从而减轻患者疾病负担。

关键词

肿瘤标志物; 循环肿瘤细胞; 循环肿瘤DNA甲基化; 非编码RNA; 细胞外基质

液体活检是一种具有动态监测优势的微创检测手段，可分析体液循环中的肿瘤特异性标志物，在临床肿瘤患者的诊疗过程中发挥着重要作用。然而，现有的肿瘤标志物在肿瘤患者早期筛查、风险分层和个体化精准治疗等方面存在特异性低、时效性差等缺点。因此，临床迫切需要表现更加出色的循环肿瘤标志物，以帮助其在面对上述问题时进行科学、合理的决策。近年来，循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）甲基化、非编码RNA和细胞外基质相关分子等新型肿瘤标志物受到广泛关注。这些指标虽然在早期肿瘤检测、预后评估、治疗和复发监测等方面具有超越现有生物标志物的潜能，但在将其应用于临床实践之前，必须克服生物学功能和检测技术等方面的诸多限制。本文将对新型肿瘤标志物在临床应用中的前景和挑战进行分析、讨论，并针对现有方法提出可能的改进思路，以期为临床研究提供参考。

1　CTC

CTC是从原发肿瘤病灶脱落至外周血循环系统的肿瘤细胞。利用液体活检对肿瘤患者的CTC进行检测，可作为预后判断和治疗监测的有效手段。目前，CTC作为肿瘤标志物的临床应用研究主要集中于CTC计数和CTC分子表达谱分析2个方面。

外周血CTC计数在以下3个方面已取得了重要进展：1）转移性复发的预后评估和风险估计。2）治疗效果评估和精准医疗的用药指导。3）药物治疗期间的动态监测。CellSearch是一种商业化CTC计数系统，基于该系统的大量临床试验证实了CTC计数在转移预测中的价值，目前已被美国食品药品监督管理局批准用于乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者的临床预后监测中。此外，基于5项独立随机临床试验的研究结果表明，在转移性前列腺癌治疗中，利用 CTC计数变化预测药物疗效比前列腺特异性抗原更准确。

除利用CTC计数监测肿瘤发展外，目前临床更加重视从CTC中获取更多的细胞和分子生物学信息。有学者建立了一种监测放疗患者CTC中细胞程序性死亡-配体1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）表达的方法，用于评估肿瘤免疫激活状态，结果显示，CTC中的 PD-L1水平与放疗患者预后不良相关。此种动态监测有2种策略：1）直接从分离的微量CTC中提取蛋白质、DNA、RNA和代谢物进行分析。2）体外培养获得大量衍生CTC，分析其生物学特性。第1种策略保留了原肿瘤细胞的生物学特性，但细胞较少、分析困难。第2种策略细胞数量大，分析准确、全面，但CTC增殖后的分子水平变化可能会产生一定的不确定性。

在临床应用方面，以CellSearch为代表的CTC计数检测系统有望在临床推广，用于肿瘤患者疗效评估和复发监测等。虽然CTC分离和计数存在设备昂贵、操作复杂的缺点，但总体临床应用前景良好。此外，CTC分子表达谱分析在临床转化中面临诸多挑战，需解决以下关键问题：1）改进现有CTC分离策略，在识别CTC的同时保持其细胞活力。2）开发适用于临床的单细胞蛋白质、核酸和代谢物分析技术。3）改良CTC离体培养技术，可通过肿瘤患者衍生的CTC细胞系对其进行校准。

2　ctDNA甲基化

ctDNA是一种存在于体液中无细胞状态的胞外DNA，通常来源于坏死或凋亡的肿瘤细胞、微转移灶，或由CTC裂解释放产生。DNA甲基化是目前被研究较多的表观遗传修饰之一，主要发生在CpG二核苷酸中，异常的DNA甲基化可促使肿瘤的发生和发展。ctDNA的甲基化模式与其来源肿瘤细胞一致，因此具有作为肿瘤标志物的潜在价值。与其他标志物相比，ctDNA甲基化具有以下优势：1）DNA甲基化发生在肿瘤早期，具有组织和肿瘤类型特异性。2）肿瘤细胞基因组DNA甲基化变化广泛、一致性强，因此可对ctDNA的多个CpG位点进行检测，检出率高。3）DNA甲基化模式通常与特定肿瘤的起源相关，可用于揭示原发灶不明肿瘤的组织溯源。

近年来，众多学者采用甲基化测序等方法证实，不同ctDNA甲基化在多种恶性肿瘤中具有作为早期诊断、疗效监测和预后判断标志物的潜在价值。美国食品药品监督管理局于2016年批准了Epi proColon用于结直肠癌早期筛查，这是一种基于检测SEPT9基因启动子区甲基化状态的产品。我国国家药品监督管理局批准了肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因甲基化检测，用于肺癌的辅助诊断。然而，目前获批的ctDNA甲基化检测试剂均基于荧光定量聚合酶链反应方法，检测灵敏度有限。

因此，ctDNA甲基化指标作为肿瘤标志物应用于临床，需要克服以下主要技术难点：1）在肿瘤负荷较低的情况下，提高ctDNA甲基化检测的灵敏度是关键。2）ctDNA特定基因的甲基化检测成本较低，但覆盖率和准确性不理想；全基因组甲基化测序则与之相反，未来如果能够降低测序成本，可能是解决该问题的有效途径。3）需规范样本分析前的质量控制，建立标准化操作程序，以提高检测结果的稳定性和可比性。

3　非编码RNA

非编码RNA主要包括微小RNA（microRNA，miRNA）、环状RNA（circle RNA，circRNA）和长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。miRNA由19~24个核苷酸组成，主要参与调节细胞发育、分化、增殖、凋亡和代谢。circRNA具有共价闭环结构，能抵抗核糖核酸酶的水解，在体内比线性RNA更稳定，可参与癌细胞增殖、侵袭和维持干性状态等。lncRNA是一类长度约为200个核苷酸的非编码RNA，在转录后或翻译水平调控基因表达和表观遗传，与肿瘤转移、复发、预后和耐药相关。以上3种非编码RNA均可由肿瘤组织直接或以外泌体的方式释放至外周血，在多种恶性肿瘤中具有作为早期诊断、预后判断和治疗监测标志物的潜能。

非编码RNA作为肿瘤标志物的优势在于：1）应用广泛，血液、尿液、胸腔积液等样本均可检测。2）具有较强的稳定性，可抵抗高温、极端pH值和长期冻存等不利条件。3）非编码RNA的检测方法是实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR），该技术成熟、耗时少、成本低。然而，非编码RNA也存在一定的缺点：1）某些非编码RNA缺乏特异性，如外周血miR-21水平升高与前列腺癌、胃癌、肺癌，甚至炎症均有关。2）结果的复现性较差，针对同一非编码RNA的不同研究会出现不一致，甚至相反的结果，这可能与样本量、统计学方法、检测方法的特异性等有关。鉴于以上缺点，非编码RNA进入临床转化阶段尚面临较大挑战。由于某些非编码RNA在肿瘤的辅助诊断和预后判断等方面明显优于传统肿瘤标志物，因此大量针对非编码RNA的临床试验正在进行。如能建立评估非编码RNA的标准操作规程，包括样本的选择、RNA抽提、检测和标准化方法的统一等，非编码RNA将有望用于临床实践。

4　细胞外基质（extracellular matrix，ECM） 相关分子讨论

肿瘤微环境在肿瘤恶性进展中具有关键作用。ECM是肿瘤微环境的主要成分之一，是由蛋白质、糖蛋白、蛋白聚糖和多糖等成分组成的复杂混合物。肿瘤发生时ECM会重塑，改变微环境的生化和力学特性，促使恶性进展和治疗抵抗。ECM重塑后其成分释放至外周血，可作为肿瘤诊断或预后判断的潜在标志物。

具有作为肿瘤标志物潜能的ECM成分主要包括以下4类：1）基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），目前临床研究较多的是MMP-7和MMP-9，二者在乳腺癌、结直肠癌、肺癌和泌尿系统肿瘤等中具有辅助诊断和预后判断的潜在价值。2）胶原（collagen，COL），COL1、COL3和COL4的降解产物是辅助诊断乳腺癌、结直肠癌和胰腺癌的潜在血清学指标，同时与患者不良预后相关；COL18A1则在肺癌、结直肠癌和胰腺癌的诊断中发挥一定作用。3）糖蛋白，主要为层粘连蛋白和骨桥蛋白，层粘连蛋白可辅助诊断乳腺癌和胰腺癌，骨桥蛋白与肺癌和胰腺癌患者的不良预后相关。4）透明质酸（hyaluronan，HA），HA降解产物可辅助诊断乳腺癌和结直肠癌，并具有监测术后疗效和复发的潜能。

肿瘤细胞之间存在的异质性会对基于可溶性肿瘤相关分子检测方法的临床应用造成一定的阻碍，而肿瘤间质ECM分子的检测可能是弥补上述不足的可行方法。因此，ECM分子与肿瘤细胞特征相关标志物，如糖类抗原（carbohydrate antigen，CA）125、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、CA15-3等相结合，将是具有临床应用前景的肿瘤诊断及治疗后随访策略。然而，ECM分子作为肿瘤标志物应用于临床仍面临较多挑战：1）ECM分子具有良好的诊断及预后判断价值，但在不同肿瘤中缺乏特异性，必须结合其他肿瘤标志物进行综合判断。2）目前，ECM分子的检测方法以酶联免疫吸附试验为主，操作复杂、通量低、耗时长，难以满足临床大样本筛查的要求。3）在选择ECM分子作为肿瘤标志物时，不仅应关注其表达水平的改变，更要关注其是否发生特异性改变（如降解片段、蛋白酶活性改变）。

5　总结

生物学技术的发展和创新为新型肿瘤标志物的开发提供了新的契机。虽然目前只有少数新型液体活检指标获批可应用于临床，但CTC、ctDNA甲基化、非编码RNA和ECM分子等标志物在肿瘤患者诊疗过程中已经展示出良好的临床应用前景。现今的难点在于这些标志物在临床转化中要克服诸多困难，主要为技术难度大、特异性较低、缺乏标准化操作规程。如果能够解决上述难题，新型液体活检标志物将发挥其动态监测的优势，为肿瘤患者早期诊断和个体化精准治疗作出重要贡献。

参考文献（略）