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冯仁丰 | 检验检测蛋白质的一些基础观点

更新时间:2022/9/18 22:10:14 浏览次数:5250

为了较多地了解,临床实验室对血液(包括血清和血浆)内蛋白质检测的一些基础内容,我将写点微信。


也许你们认为这些不是问题。但是我有许多没有理解和清楚的事。例如:究竟我们检测的这些蛋白质是血清的、还是血浆的?也即,不少文章都写为血浆蛋白质,而有的写为血清蛋白质?仅仅是检验科在病人那里取样,成为血清或血浆决定的?好像不是这样!


为什么那么多的蛋白质的定量结果,都采用了g/L(mg/L、μg/L等)?为什么不能表达为mol/L?


究竟是怎样确定某个蛋白的量的?是以纯化的某个蛋白为准,来确定样品中的蛋白含量的,那么我们又怎么确定纯化蛋白质的量?


为什么,上世纪80年代末,出现的散射比浊和透射比浊方法是对临床实验室检测样品中各个蛋白检测,具有划时代的意义?


上世纪90年代初,美国和欧洲联合开发了一个具有基质的二级参考物质CRM 470(后被称为ERM DA470)。这个参考物质在促进全球多个蛋白质的可比性上起了什么巨大作用?还有很多很多。


我将自己的学习体会写出来,供大家参考。因为,这对于我们理清思路,做好检验工作很要紧!


对我的微信中的一些观点有不对、甚至错误的地方,由衷希望大家提出宝贵意见。共同提高。


蛋白质系列的微信第一篇,就关于在某个蛋白质名称之前,应该是血浆的还是血清的?讲点我的观点。


在很长时间里,检验界已经懂得,要为某个蛋白质定量检测,一定要有这个蛋白的纯物质。这是确定这个蛋白质量的要求。这个观点其实在各行各业的分析中,都强调要有被检测的纯物质。蛋白质也一样。因此,在上世纪60年代起,就有专家从人血液中提取某个蛋白质,想尽方法去纯化。这样,需要大量的人血液。


血浆虽然不是一种重要的体液,但在18世纪那个时期是人们研究的热点。1830年Justus Von Liebig和Gerrit Jan Mulder分析了“白蛋白”这种物质,并将其与“纤维蛋白”区分开来。


近100年来,有两个研究小组从根本上改变了人血浆蛋白质的化学理念。Edwin Cohn和John Edsall在第二次世界大战期间进行血浆分离和制备的研究,从而得到大量的白蛋白和γ-球蛋白供临床治疗之用。至今,他们形成的方法依然用于血浆分离制备产业。1950年在人血浆中确认出10个不同的血清蛋白。第二个研究小组,即Hermenn Schultze和Hans-Gerhard Schwick,使用了一个特殊的乙醇(利凡诺[rivanol])沉淀技术,分离和结晶出更多的人血浆蛋白质。分离出来的白蛋白被称为(Cohn Fraction V [HSA V])。然后他们去形成抗这些蛋白质的抗体,将这些技术和信息传播到世界各地用于研究和诊断。以后为蛋白质分析形成了简单的免疫化学方法,使各地的研究人员去发现特定蛋白和确诊疾病间的新关系。


因此,从那时开始,凡是要使用人血液作为原料,提取需要的某个蛋白质的做法,几乎都是采集血液供体的全血,与抗凝剂混合,分离出血浆备用。在开始提取某个需要的蛋白前,加入凝血酶,使内含的纤维蛋白原成为纤维蛋白,离心或过滤去除后,即成为人血清。然后再使用这样的血清进行提取或加工处理。这样的做法在上世纪80年代非常普遍。但是,这样的加工程序,最后得到所需要的纯化蛋白,经过冷冻干燥后的制品,加入水复溶的蛋白溶液大多是浑浊的。尽管将这样的制品存放在低温保存,无法消除复溶后蛋白溶液的混浊,而且随着制品使用时间的推移,出现的浑浊现象越来越明显。


好在在上世纪80年代,进行人血液蛋白质检测的定量方法,最可靠的是免疫扩散方法。将制备的参考蛋白溶液,滴加在具有蛋白抗体的琼脂板上的样品孔内,让其自然扩散。在某个扩散区域处,抗原抗体达到最佳比率下,形成抗原抗体复合物沉淀,在实验琼脂板上出现了沉淀环。以沉淀环出现的直径,与参考蛋白溶液(具有确定蛋白量)的直径比较,确定样品内这个蛋白质的含量。这个方法当时在参考实验室的精确实验操作,他们的检测结果被国际认可为定量样品中蛋白质的参考值。


免疫扩散方法被全世界所有临床实验室普遍使用。但是实验室需要进行检测的标本量很大,使用单向免疫扩散实验对每个样品去检测蛋白质含量的检测结果,具有很大的误差。因此,在临床实验室认识上,这样的免疫扩散法在方法学上很差。必须淘汰


为了提高临床实验室对各类血液蛋白质的检测质量,随着自动分析仪在实验室的普遍采纳,使用光学原理对样品中各个分析物检测的方法已经在全世界普及。使用光学方法是否可以对血液蛋白质进行检测,开始被一些体外诊断厂商内的专家思考。


上世纪80年代,德国的Behringer公司,著名的免疫学专家Dr. F. Dati和Dr. E. Metzmann参与进行了免疫散射比浊方法的研究;在美国的Beckman也开始了免疫散射比浊的研究。


在“蛋白质-实验室检测项目临床应用指南”书中指出:透射免疫比浊测定为实验室面向病人提供了重要的手段。历史上多年来,因经济原因而不是学术上的缘故,才使散射免疫比浊法较透射比浊提供了较多的检测项目。注:这两位专家原先为德国Behring公司(后为德灵公司部分、现西门子公司)服务,他们深深了解散射比浊和透射比浊的问题。


是他们,从理论到实践,在临床实验室的免疫检测方法学上创建了,采用犹如一般临床化学分析物在自动分析仪上,使用光学原理进行免疫散射和透射比浊方法,对各类蛋白检测的新技术。这项技术的出现,彻底地颠覆了原先的免疫检测技术,使免疫化学对血液蛋白检测得到的结果,在方法学上具有的精密度和可靠性完全展现出以往没有的水平。为此,在临床免疫检测上,迫切需要没有浑浊表现的参考物质,作为可靠的校准品。


为此,推动了上世纪90年代的世界上顶级的免疫化学专家,重新建立一个以血清为基础的各个蛋白质的二级参考物质,这就是CRM-470。这个参考物质的出台,使全世界十余种人血清蛋白的检测结果可比性有很大的提高。


以后,为了更好地满足临床对病人疾病诊断和监视的需求,在检测病人标本的各个蛋白质中,从方法学和参考物质的改善上不断在进步和提高。逐步走到现在的情况。


说到这里,我似乎没有对文章开始提及的问题做出回答。即,究竟我们现在称呼,各个检测蛋白质,应该是血清蛋白质还是血浆蛋白质?我发现,Dr Dati那本著作中,他讲得也很糊涂。一面是使用了血清为检测样品,但是检测的又是血浆蛋白。究竟应该怎么说?我将在第四个微信中说说我的认识。


这次我准备了些各个蛋白质检测基础内容,将逐一向大家介绍走过来的路。

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