林勇平：医学博士，副教授，硕士研究生导师，现任广州医科大学附属第一医院检验科副主任，医院医学转化研究实验室负责人，广州医科大学金域检验学院分子诊断学教研室主任。

目前学会任职有中国检验检疫学会卫生检验与检验专业委员会副主任委员，中国研究型医院学会细胞外囊泡研究与应用专业委员会常委，中国医学装备协会检验医学专业委员会委员，中国老年医学会老年检验医学分会委员，广东省医师协会转化医学工作委员副主任委员，广东省精准医学应用学会精准检测分会副主任委员，广东省医学会检验分会委员兼分子诊断学组副组长，广东省免疫学会常务理事，广东省医院协会临床实验室管理学会常委、广州市医学会检验分会副主任委员。《国际检验医学杂志》、《Frontiers in LaboratoryMedicine》编委、《中华检验医学杂志》审稿专家。

2011年香港大学医学院博士毕业，曾主持完成广东省自然科学基金面上项目和广东省科技计划项目各1项。现主持广东省科技计划项目1项，以主要负责人参与国家自然科学基金等项目多项。发表学术研究论文40余篇，包括在PNAS，J Immun, EID等国际著名杂志参与发表SCI文章近30篇，影响因子超过90，单篇他引次数超过200，参编国家级高等医学检验教育规划教材1部。申请美国专利1项，并已成功转让给香雪制药香港公司。学术专长为临床生化与分子生物学检验。

广州医科大学附属第一医院检验科副主任林勇平教授带来了“ctDNA检测技术及临床实践”的精彩演讲。

林教授首先介绍了液体活检与精准医疗，精准医疗是一个非常热门的话题，从美国前总统奥巴马提出，到我国正式实施，涉及的是一个系统的问题。从药物研发到人类的基因准学，在临床上来说肿瘤药物治疗正处于重大变革时期，最初组织分型指导下的传统化疗，它的弊端是：①少数受益；②多数无效；③副作用大。发展到分子分型指导下的精准靶向治疗其优点显而易见：①多数受益；②少数无效；③副作用轻。

分子检测与药物使用同样重要。感染性疾病是一个定性免疫的现象，以肺癌驱动基因与个体化治疗为例：近年来，肺癌依然是我国发病率最高的瘤种，且发病率与死亡率逐年上升，对肺癌的精准治疗显得尤为重要。精准治疗的基础在于精确诊断，如何将肺癌进行准确的分型始终是精确诊断中关键的一环。非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer；NSCLC）和小细胞癌（small cell lung cancer）是肺癌的两大主要病理组织学类型，其中，NSCLC占到85%以上，包括腺癌、鳞癌、腺鳞癌和大细胞癌等。目前，随着分子生物学研究的不断深入和基因技术的不断提高，肺癌的靶向治疗进展迅速。目前已知的靶点众多，包括EGFR、KRAS、ALK、HER2、ROS1、RET、BRAF、NRAS、PIK3CA、MET等，EGFR突变再度细分，最常见的突变位点为19外显子缺失突变和21外显子L858R突变，针对这些靶点使用靶向药物，可以显著延长患者的无进展生存期（Progression-free survival，PFS）。另外，在使用EGFR TKIs（吉非替尼或厄洛替尼等）后，患者不可避免地产生获得性耐药，目前的研究证实相当一部分原因与T790M位点突变有关。使用针对这一耐药基因的靶向药物能够再次为患者带来生存获益。但反之，若患者没有这些基因突变，则使用靶向药物疗效非常有限。因此，准确对突变状况进行检测是NSCLC靶向治疗的前提和基础。

目前，组织/细胞学检测依然是检测的金标准，其依赖于有创性组织病理活检和细胞学检查，但临床上相当数量的肺癌晚期患者往往难以取得足够数量的肿瘤组织标本，重复获取难度较大，更难于进行实时检测；且组织样本进行活检取样时要面临肿瘤异质性的问题，寻找肿瘤组织替代材料用于基因诊断是当前迫切需要解决的问题。

循环肿瘤DNA（Circulating Tumor DNA; ctDNA）是指肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或细胞凋亡后释放进入循环系统，其存在于外周血循环系统中。对ctDNA进行检测，以判断NSCLC患者的基因突变状态，可以作为组织/细胞学病理的有效补充。ctDNA的特点在于其高度片段化，但大小相对一致；半衰期短，可以实时反映肿瘤的变化情况；且其在肿瘤患者体内浓度超低，与临床分期、分化程度密切相关。相较于组织/细胞学活检，其优势在于无创检测，取样方便，解决部分晚期患者没有足量组织样本的难题；ctDNA在体内循环，能够综合反映整个肿瘤组织，克服肿瘤异质性问题；且ctDNA的检测基于外周血，方便重复取样。

ctDNA技术可以应用于指导临床用药，动态监测，以及发现新的耐药机制。广州医科大学附属第一医院2012到现在完成在诊治的肺癌6000多例，很重要的一个数据就是突变率，广医一院实验室的突变率是40%，这部分的病人就可以用药物治疗，作为一个晚期的癌症患者来说，他能从几个月延长至三年的存活时间，这是一个巨大的进度。

林勇平教授指出循环肿瘤DNA（ctDNA）的检测技术目前常用的方法有数字PCR (digital PCR, dPCR)、BEAMing (bead,emulsion,amplification and magnetic)、高通量测序(nextgeneration sequencing, NGS)、ARMS等。

数字PCR

数字PCR包括两部分，即PCR 扩增和荧光信号分析。先将是样品稀释后分配到大量微小的反应单元中，每个单元包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子,然后分别对目标分子进行扩增，扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。不同于传统的qPCR技术,数字PCR 不受扩增曲线的循环阈值(CT)和扩增效率的影响，无需参照，准确性和重复性好，可实现绝对定量分析。

BEAMing技术

BEAMing技术在检测ctDNA内体肿瘤突变具有非常高的灵敏度，它是结合了数字PCR以及流式技术的一种检测方法，最早是由Bert Vogelstein提出。其方法是每一类DNA分子都会专一的与磁性珠相连接，然后DNA分子之间的差异可以通过流式细胞仪检测荧光标记来做出评估。这种方法是基于小珠(Bead)、乳浊液(Emulsion)、扩增(Amplification)、磁性(Magnetic)，这四个主要组分来构建的，所以被称作为BEAMing。

NGS技术的检测方法

ctDNA检测技术，除了基于PCR检测方法之外，还有一种以高通量测序技术，又称“下一代”测序技术（NGS）为基础的检测方法。这种方法主要是选定十几到几十个肿瘤相关基因进行测序，测序通量和效率高。基于NGS技术的检测方法灵敏度高，能同时检测多个基因的多种变异。但是其技术复杂，数据处理困难，实验室水平差异较大，仪器与试剂的成本相对较高。想要临床应用，首先要将其标准化。

作为重要的肿瘤分子标志物，ctDNA在肿瘤的诊断、治疗监测、预后等方面发挥着重要的作用，而DNA测序技术的发展使得通过检测ctDNA来指导肿瘤的临床进展变得更加切实可行。数字PCR技术、BEAMing技术、NGS技术、ARMS技术在ctDNA的检测中各具其独特的优势和不足之处，实际应用时应结合具体条件决定采用何种检测方法。相信随着技术的进步，ctDNA 将会逐渐从科研领域向临床转化发展。