第一章  病理检测发展历史及趋势

第一节 概述

传统的病理检测，主要由三大业务支柱所组成，即人体病理解剖（Autopsy）、活体组织检查（Biopsy）和脱落与穿刺的细胞学（Cytology）检测。新中国成立的60年以来，各时期三大业务支柱的发展规模和进步程度不尽相同。人体病理解剖虽属疾病死亡后的检测，但作为最终明确疾病诊断和寻求病因上，有着绝对不可替代的指导作用。全面分析人体各器官病变因果关系，厘清主次，明确而具有说服力地表述人体解剖所见，做出判断，是最真实反映医学学术水平的实践。50年代人体解剖检查备受重视，建立了良好的工作条件和执行规范。解剖后的临床-病理讨论会曾是座无虚席的课堂。

活体组织检查，专业上也称之为外科病理学（Surgical Pathology），是病理部门每日的常规工作。80年代以来，基于医院的大发展和学科门类细化和工作扩展，活体组织检查工作量大增，三甲医院通常达到每年3-5万例，甚至更多。活体组织检查常作为疾病诊断的“金标准”，是为临床评估预后、处理治疗的重要依据。病理部门投入主要精力和良好装备服务于外科病理学，临床各专业医师期待与时俱进、精准的病理诊断和规范的病理所见描述。

脱落细胞学和细针穿刺抽吸（Fine Needle Aspiration）细胞学检查，基于获取检样相对简便易行，不仅是病理部门常规业务，也是规模化群体疾病防治筛查的有力工具。50年代后期脱落细胞学检查已用于宫颈癌防治普查，目前已全国广泛定期开展。细针穿刺抽吸细胞学，适用人体各内脏与皮下、软组织。在十分关注细胞学检测的病理部门，其业务总例数远超活体组织检查的工作。

第二节 病理检测技术发展及其应用

追溯病理检测技术发展历史，宏观上可划分两大历史时期，即80年代以前的病理解剖学时期和80年代以来的病理生物学时期。病理解剖学时期的病理检测是建立在解剖学理论和实践基础上，以认知疾病所致结构异常为主。病理解剖学时期，仍可细分为器官病理学和细胞病理学两阶段。前者以肉眼，或借助放大镜观察、描述疾病的器官异常；后者进入借助光学显微镜和组织染料阶段；得以获取显微镜下细胞、组织的疾病结构异常。60年代电子显微镜的应用，使疾病结构异常深入到亚细胞，即细胞器水平。至于病理生物学时期的病理检测，是进一步建立在当代生物学理论和实践基础上，即免疫学、细胞遗传学、分子生物学等。在免疫学方面，引进抗原-抗体反应原理，建立起免疫组织化学技术和应用。在细胞遗传学方面，70年代引进人类染色体显带技术（Banding Technique），建立起细胞核型分析（Karyotype）的检测。在分子生物学方面，引进当代核酸结构和功能的认知，在理解基因序列（DNA）、基因表达和翻译（Transcription & Translation）的各自作用和生物学意义基础上，建立起疾病的分子病理学，即疾病的分子检测和诊断。在DNA、RNA和多肽、蛋白质水平上，揭示疾病时人体内的外源性基因的存在和内源性基因的突变及其表达异常。外源性基因来自感染、移植和基因治疗。内源性基因突变包括基因扩增、基因丢失、基因易位和基因点突变等。国内80年代逐步普及免疫组织化学应用。90年代伊始开启了分子病理学的发展阶段，标志着疾病的病理检测，从整体、器官、细胞、亚细胞，进而涉及DNA、RNA和多肽、蛋白质；不仅关注疾病的表型（Phenotype）,同时关注基因型（Genotype）的疾病异常。21世纪以来，随着人类基因图谱（Gene Map）日益详尽，测序技术跨代进步，让大数据的个体基因组的认知和分析成为现实。病理部门拥有极大数量的疾病组织，揭示当代和未来人类疾病基因组结构和功能异常，将成为当今热点的精准医学（Precision Medicine）的重要组成和前提。

第三节 病理检测产业的发展和趋向

病理检测，属于疾病的体外诊断（In-vitro-diagnosis），病理检测各阶段的进步，离不开相关仪器设备研制和试剂耗材的有力支持。传统病理解剖学阶段，主要有切片机系列、显微镜系列以及自动组织脱水、包埋仪系列支撑。病理生物学阶段，新仪器和新试剂更是关键必需。免疫组织化学检测，必备各类单克隆、多克隆抗体。目前日常检测应用的抗体百种以上，可供选择应用的抗体上千种。免疫组织化学自动化染色仪的应用，有助于免疫组织化学操作的进一步标准化。目前国内企业已有自主产权的多种抗体和免疫组织化学自动化染色仪。分子病理学检测，包括原位杂交、荧光探针核酸扩增检测即Real-time PCR、多重PCR（Multi-PCR）、微卫星不稳定性（Microsatellite Instability，MSI）检测、微阵列（Microarray）检测以及核酸测序（Sequencing）等，各自需要专用精密设备和特定试剂。多品种和大数量的应用需求，推动与病理检测相关的体外诊断事业，成为21世纪最活跃的高新工业。其中分子诊断应用，2004年国际预测，将从当时年增长率9%，扩展到年增长率达25%-35%，已预见相关产业发展的高速度和蓬勃前景。国内相关企业，近十年来进展迅速。可提供部分相对低端设备如PCR仪、原位杂交仪等以及试剂。引领时代的高端仪器如二代测序仪、自动化微流控装置的多重PCR仪与其伴随/伴同诊断实验（Companion Diagnostic Test）的试剂，仍属国际企业独有专利产品。有待国内企业进一步整合实力，迈向高端、精密、自动化装备的行列。

第四节 病理行业相关政策和法规

病理检测是作为医院常规工作，建有病理科室。基于近30年业务的大发展，病理部门出现以下业务需求：1. 活体组织检测和细胞学检查几倍的数量增加；2. 临床各专业高度细化，客观上要求病理亚专业化相适应；3. 新技术、新装备不断涌现，并高度专业化；要配备门类多样的技术平台。国内大型院、校适当扩大编制，选择特色发展领域，尚可跟上当代进步水平。相对小型医院的病理科室难于齐全地装配。尤其面临分级医疗的大趋势，整合组建病理中心或借助社会力量组建第三方实验室，成为发展的选择。近期国内系列文件指导施行。中央、部委和地方发布文件有：《国务院关于促进健康服务业发展的若干意见》（国发[2013]40号），《国务院办公厅关于推进分级诊疗制度建设的指导意见》（国办发[2015]70号），《国家卫生计生委关于印发病理诊断中心基本标准和管理规范》，北京市卫计委制定的《病理诊断中心基本标准（试行）》和《病理诊断中心管理规范（试行）》。病理行业迎来再整合、谋发展的新阶段。

医院病理部门，与医院检验科室比较，在实验室制度化和质控管理上稍滞后，近年来在由上而下完善管理机构，规范部门建设，完善实验室管理，并分别推行专项质检和室间认证，逐步制度化。国内已有病理部门参考美国CAP（College of American Pathologists）所制定的规范建设，甚至个别部门通过CAP的认证。在病理部门所建设的实验室如核酸扩增临床检验室，即PCR实验室，可获得国家卫计委下设临床检验中心的评估和认证，参与室间质评。科学、合理、规范的制度化管理是病理检查部门健康发展的保证，病理学工作者在努力进行中。

病理检查部门日常服务，离不开关键设备和试剂。涉及体外诊断设备和相关试剂的认证制度问题。参考国际行业管理经验如美国，根据CLIA（Clinical Laboratory Improvement Act）规则，把实验室医用试剂按复杂程度划分三大类：不复杂、中度和高度。以分子病理诊断试剂为例，多属中度和高度复杂程度。至于行业认证，也有三大类的区分。有规范、合格实验室制备的，名为自制（Homebrew）；经规范、合格的企业车间制备的，名为特殊分析试剂（Analyte-specific Reagents, ASR）；第三类是经过FDA认证的。以美国过去调查得知，FDA通过的分子诊断产品，只占实际所用的十分之一。另外，基于科学技术发展迅速，产品不断优化、更新换代。现实自制的或ASR试剂有的也已达到临床应用的要求。要善于解决产品进步和行业管控间的不同步，发挥好权威机构的引领和指导作用。

第二章  免疫组织（细胞）化学试剂及仪器

第一节 免疫组化原理及发展历程

一、免疫组化的概述

免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC，简称“免疫组化”）是利用抗原与抗体间的特异性结合原理和特殊的标记技术，对组织和细胞内的特定抗原或抗体进行定位、定性或定量检测的技术。免疫组织化学技术具有特异性强、敏感性高、定位准确、形态与功能相结合等特点，有利于病理学领域的深入研究，在现代病理诊断中起重要作用。

二、免疫组化发展历程

1966年，Nakane用过氧化物酶代替荧光素标记抗体，将酶催化底物反应的高效性与抗原抗体反应的特异性相结合，使反应灵敏度大幅提高，此技术一直沿用至今。1975年，单克隆抗体技术的发明提高了抗体的特异性和稳定性，满足了市场应用需求。1981年，美籍华人许世明等建立了ABC法，大大提高了免疫组化方法的敏感度。1991年，石善溶教授发明了抗原修复技术（Antigen Retrieval, AR），免疫组化检出率得到显著提高，随后被列入病理技术室的日常工作规范中。随着抗原修复技术在病理诊断中的广泛应用，内源性生物素易造成假阳性结果问题日益突出。国外研究人员发明了敏感性高、孵育时间短的聚合物法（Polymer System），有效解决了生物素检测系统带来的假阳性问题，是目前最常用方法。

第二节 免疫组化发展现状

一、技术发展现状

免疫组化相关技术大多被外资企业所垄断，免疫组化一抗、检测系统及自动化染色系统等核心技术主要掌握在少数欧美国家手中，国内绝大部分免疫组化相关试剂和自动化染色系统长期依赖于进口。近些年来，我国免疫组化行业发展迅速，市场需求呈爆发式增长，产品国产化意识日益增强，国内企业抓住机遇，大力开展自主创新，不断研发出具有自主知识产权的产品，包括免疫组化试剂和自动化染色系统，凭借优质的产品性能和良好的服务质量打破了外企的垄断地位，逐渐具备与国际巨头竞争的实力。

1. 抗体

病理科日常工作使用的免疫组化抗体品种达数百种，对人类疾病的诊断和治疗发挥着重要的作用。随着人类对疾病认识的不断提高，病理科应用的抗体种类也逐渐增加。免疫组化中所使用的抗体，又称为一抗（Primary Antibody）根据其制备方式可分为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体因其特异性高广受免疫组化使用者的喜爱和青睐，在病理科使用的抗体中占绝大多数。单克隆抗体包括有鼠单克隆抗体和兔单克隆抗体。鼠单克隆抗体技术从1975年发展至今有40余年历史，该技术已被大多数有研发能力的免疫组化企业掌握。但兔单克隆技术由于兔骨髓瘤细胞株的开发专利限制，目前只有少数几家企业拥有兔单抗的制备技术，如Abcam公司生产“EP”系列兔单抗和Spring Bioscience公司生产的克隆名以“SP”开头的系列抗体。

我国能够生产、销售病理科免疫组化抗体的企业有3种类型：（1）跨国免疫组化企业，如Roche、Leica、Dako等公司，这些公司有抗体开发、制备和生产能力；（2）国内多数免疫组化小型企业，无抗体开发、制备能力，通过购买浓缩抗体作为原材料将其分装或加工成即用型抗体；（3）国内少数免疫组化企业，如福州迈新公司拥有抗体开发、制备和生产能力，能够生产体外诊断级别的免疫组化单克隆抗体。

2. 检测放大系统

免疫组化染色中抗原抗体结合微弱且不可视，通常使用一种可与一抗特异性结合，且将抗原抗体结合信号放大的染色系统，这种联合作用的系统称为检测放大系统。检测系统多种多样，总结差异主要有三点：①种属的不同：主要有抗鼠的、抗兔的、抗羊的；②标记物的不同：可分为荧光标记、酶标记和亲和组织化学标记；③标记技术的不同：包含直接标记法、聚合物链接法、亲和素-生物素法。

在众多检测系统中，最早的检测放大系统是采用直接法在抗体的末端直接标记荧光染料或可见色源，但染色信号微弱。随着技术的不断进步，出现了间接检测放大系统——生物素检测系统，后因内源性生物素易造成假阳性结果逐渐不被使用，主要代表有ABC检测系统、迈新公司的SP检测系统、Dako公司的LSAB检测系统。聚合物法检测系统是目前免疫组化检测放大系统的主要方法，将二抗和酶都链接在聚合物上形成螯合物与第一抗体结合，有效解决生物素法的假阳性问题，使免疫组化技术更特异、更敏感、更简化，主要代表有Dako公司的EnVision检测系统、迈新公司的MaxVision检测系统、Leica公司的Novalinker检测系统等。

3. 手工染色技术和自动化免疫组化

手工免疫组化染色是指免疫组化染色过程中主要步骤，如试剂滴加、孵育时间、孵育温度、冲洗等条件都由人工完成。手工免疫组化染色是病理技术人员需要掌握的基本操作技能之一。自动化免疫组化指免疫组化染色过程中主要步骤都由电脑软件和机械自动化控制，根据仪器自动化程度可分为半自动化和全自动化两种，区别在于能否自动完成免疫组化的脱蜡和抗原修复步骤。与手工染色相比，自动化染色的优势主要体现为染色结果具有良好的一致性和可重现性，利于操作程序标准化和质量控制。劣势主要体现在成本相对较昂贵，灵活性相对较小。但不论是手工还是自动化免疫组化染色，制定标准的染色流程和规范的管理制度是染色结果可靠性的保障。

二、应用现状

免疫组化作为一种原位显示技术，在病理科日常诊断工作中起到不可或缺的作用。

1. 免疫组化在病理工作中的应用

一方面，免疫组化能够辅助诊断和鉴别诊断，为病理诊断和鉴别诊断提供客观证据。对于感染性疾病，通过免疫组化技术识别特定的细菌、病毒等微生物，提高感染性疾病病理诊断的准确性。对于肿瘤性疾病，免疫组化也通过多种途径来提供客观的诊断依据辅助病理诊断工作：（1）肿瘤良恶性判断。（2）确定肿瘤细胞来源。免疫组化可提供组织分化信息帮助病理医生判断原发性还是转移性。（3）鉴别诊断肿瘤类型。低分化或未分化的肿瘤，以及形态学特点较为一致通常难以区分肿瘤类型，免疫组化可提供有效肿瘤分化特征以辅助肿瘤的鉴别诊断；（4）肿瘤分级，如Ki-67抗体可以用于脑胶质瘤的分级；（5）肿瘤微小转移灶的发现和确定，在淋巴结或其他组织中，因为组织中有大量不同的细胞存在，少数或微小的转移性肿瘤容易被疏忽从而造成漏诊，免疫组化可以依靠抗体的特异性在蓝色的背景中突出显示不同于背景颜色的肿瘤细胞。

另一方面，临床诊断的要求是不但能够准确地鉴别出疾病的类型，而且还能为疾病治疗提供客观的指导方案，即伴随诊断。伴随诊断是一种体外诊断技术，能够提供有关患者针对特定治疗药物的治疗反应的信息，有助于确定能够从某一治疗产品中获益的患者群体，从而改善治疗预后并降低保健开支。免疫组化在肿瘤的治疗中通过以下三点来达到和实现伴随诊断意义：（1）靶向药物肿瘤靶标的测定，如乳腺癌或胃肠道腺癌C-erbB-2抗体染色结果可以指导HER-2单抗药物用药，CD117用于胃肠道间质瘤的鉴别，进而备选格列卫药物的靶向测定等；（2）肿瘤化学性药物治疗反应的预测如ER、PR用于乳腺癌患者他莫昔酚（Tamoxifen）药物疗效的预测；（3）肿瘤预后的判断是个综合性评估，通过不同的免疫组化指标，如乳腺癌可以使用ER、PR、HER-2、Ki-67、CK5/6等抗体，根据抗体染色结果将肿瘤分成几种不同类型，每种类型都有不同的临床特定和疾病转归，从而对乳腺癌的预后做出指导性的判断。

2. 国内免疫组化应用现状

受我国现有国情影响，免疫组化在我国医院病理科应用中存在以下几个特点。

（1）分布不均衡情况

在我国少部分二级甲等医院和几乎所有三级医院均有开展，大多数二级甲等医院及以下都由于病例量小而无法开展免疫组化或将病例送至省内大型三甲医院病理科进行会诊。因此三甲以下医院病理科所使用的免疫组化量少，且抗体品种也较少，通常是免疫组化结合病理形态学能判断肿瘤良恶性、判断恶性肿瘤的来源即可；而三甲医院免疫组化用量占整体用量的绝大多数，抗体品种也高达数百种，几乎覆盖到所有免疫组化用途。

（2）室间室内质量控制规范少

免疫组化染色结果已经可作为疾病鉴别、治疗和诊断的依据，结果的准确性和可靠性意义重大。而国内实验室之间的操作标准、管理规范不同，实验室免疫组化染色水平参差不齐。

（3）实际需求同国家规范化管理间的矛盾

当前国家食品药品管理局（CFDA）对免疫组化抗体试剂按照三类管理，是全世界目前最严格的管理。目前市场上免疫组化三类注册证产品种类较少，品种增长速度缓慢，且受市场需求影响，注册产品种类集中，同一抗体同时存在多个注册产品。免疫组化三类注册证产品无法满足病理科的临床需求，临床单位存在用无证产品情况。

（4）企业投入不足，有研发能力的企业少

在我国免疫组化产业发展初期，国内企业研发机构数量较少，研发能力不足，长期的代销商模式致使国内技术水平发展缓慢。近些年来，跨国公司又通过低价或投放免疫组化自动化染色仪器的形式迅速抢占中国免疫组化市场。总体而言，国内外企业在免疫组化试剂和染色系统的研发技术和生产能力方面都存在较大差距。但是，国内企业已深刻认识到提升自主研发能力的重要意义，逐渐加大企业人力、物力、财力的投入，不断增强企业的科技实力，部分企业已拥有自主知识产权的免疫组化产品，如福州迈新公司拥有免疫组化单克隆抗体和染色系统。但研发需要时间，在产品成熟之前，国内免疫组化企业难免要面临因技术所造成的不平衡竞争。