作为目前最重要的两种表观遗传学改变，DNA的5-甲基化和5-羟甲基化水平在肿瘤的发生发展中发挥了重要的作用。5-甲基化可以导致基因沉默或基因表达水平降低，因此，肿瘤抑制基因的过甲基化或原癌基因的低甲基化现象被发现存在于多种类型的肿瘤中。另外，作为去甲基化过程的第一步的5-羟甲基化则会导致基因激活或基因表达水平增高，并且DNA的5-羟甲基化水平在多种肿瘤中也明显降低。因此，定量检测分析肿瘤基因组的5-甲基化和5-羟甲基化水平具有重要的临床意义。

四川大学华西医院刘继彦课题组和美国辛辛那提大学刁佳杰课题组综述了可用于定量检测肿瘤基因的5-甲基化和5-羟甲基化水平的单分子测序技术，包括纳米孔测序技术、单分子实时测序技术、单分子光学图谱技术及单分子荧光成像技术。该文发表在VIEW上（DOI:10.1002/viw2.9）。

用于定量分析5-甲基化和5-羟甲基化水平的技术中，单分子测序技术以其较高的敏感性吸引了研究者们的注意。四川大学华西医院刘继彦课题组和美国辛辛那提大学刁佳杰课题组总结了目前的单分子测序技术，并基于检测信号的类型将单分子测序分为了两大类，分别是基于电学信号的纳米孔测序技术，和基于光学信号的单分子实时测序技术、单分子光学图谱技术及单分子荧光成像技术。纳米孔技术是通过检测5-甲基化胞嘧啶或5羟甲基化胞嘧啶通过纳米孔时，导致纳米孔关闭，从而导致的电流变化的不同来定量分析单链DNA分子中的5-甲基化或5羟甲基化水平的（图a），纳米孔测序技术的优势在于不需要对样本进行标记和扩增。在单分子实时测序技术，需要首先将用于检测DNA序列的单个核苷酸分子标记上荧光基团，然后以样本单链DNA为模板，通过分析双链DNA合成过程中发出的不同荧光脉冲信号来检测模板DNA单链的序列，同时根据动力学信息，可以将模板DNA单链中的胞嘧啶碱基和5-甲基化或5羟甲基化的胞嘧啶碱基区分开（图b）。单分子实时测序技术的优点在于其读长长度可达到1.5kb。单分子光学图谱技术则是首先将样本DNA的5-甲基化胞嘧啶或5-羟甲基化胞嘧啶标记上荧光基团，然后通过荧光显微镜观察单链DNA分子通过纳米槽时形成的荧光代码信号来定量分析DNA的5-甲基化或5-羟甲基化水平（图c）。单分子荧光成像技术也是通过将DNA的5-甲基化胞嘧啶和5-羟甲基化胞嘧啶标记上荧光基团，然后进一步通过全内反射荧光显微镜来获得DNA的5-甲基化或5-羟甲基化水平信息（图d）。单分子光学图谱技术和单分子荧光成像技术的优势都在于并不需要复杂的后期数据处理，就可以很直观的获得DNA的5-甲基化或5-羟甲基化的定量信息。并且，单分子荧光成像技术还可以进一步获得DNA分子中5-甲基化和5-羟甲基化两者之间的位置的信息。

研究者相信，由于光学检测技术和电学检测技术的发展，单分子测序技术也终将取得更大的发展。另外，将不同原理的单分子测序技术整合或者将单分子测序技术与传统的测序技术联合，取长补短，也会是未来单分子测序技术发展的新方向。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/viw2.9

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